Source | 문제점 | 원인 | 해결 방법 |
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Incorrect Basecalling |
Too many mixed bases called |
분석하고자 하는 핵산 주형에 2차 프라이머 부위들이 존재할 경우 |
염기서열분석용 프라이머를 다시 디자인하십시오. |
PCR 산물에 이차 증폭 산물이 포함되어 염기서열 분석용 주형으로 이용되었을 경우 |
• 분석하고자 하는 주형만을 gel purification 방법으로 분리하십시오. • 새로운 PCR 프라이머를 디자인하거나, 단일 산물을 얻을 수 있도록 증폭 조건을 최적화하십시오. |
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PCR 프라이머들이 완벽히 제거되지 않은 채 염기서열분석을 실시할 경우 |
PCR 산물을 염기서열분석용 주형으로 사용하기 위해서는 PCR 프라이머가 완전히 제거되어야 합니다. |
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주형이 혼합되었을 경우 |
DNA 품질을 확인하십시오. |
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PCR 증폭 또는 염기서열 분석 반응 중 나타나는 “Stutter” 현상은 2개 염기보다 큰 영역의 homopolymorpic 영역에서 흔히 발생합니다. 또는 반복서열의 결과일 수도 있습니다. |
만일 PCR 증폭시 “Stutter” 현상이 발생한다면, 반복 서열을 포함하는 염기서열분석용 프라이머를 이용하는 것 외에 특별한 해결방법이 없습니다. |
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Irregular Signal |
No signal or low signal |
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- No signal |
Phenol이나 Ethanol, Washing 용액 등 염기서열 분석반응을 저해하는 용매가 포함되어 있을 경우 |
일반적으로 추천하는 방법에 따라 염기서열 분석용 주형을 분리해 주십시오. DNA 품질을 확인하시고, 만일 필요할 경우 주형을 정제하십시오. |
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부실한 프라이머 디자인으로 인해 프라이밍이 약할 경우 |
새로운 프라이머를 디자인하신 후 염기서열 분석을 다시 의뢰하십시오. |
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- Low signal throughout |
주형, PCR 산물의 불충분한 정제, 또는 염기서열 분석반응을 위한 ethanol 침전시 염(salts)이 포함되어 있을 경우. 이러한 염(salts)은 적절한 전기적 반응을 방해하여 염기서열 분석 결과를 나쁘게 만듭니다. |
DNA 품질과 PCR 정제, 그리고, 염기서열 분석반응을 위한 정제 과정을 다시 한번 잘 확인하시기 바랍니다. |
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부실한 주형의 품질 |
일반적으로 추천하는 방법에 따라 염기서열 분석용 주형을 분리해 주십시오. DNA 품질을 확인하시고, 만일 필요할 경우 주형을 정제하십시오. 염기서열 분석반응을 확인하기 위해 컨트롤 DNA 주형과 함께 반응을 의뢰하시기 바랍니다. |
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분석이 어려운 서열을 가진 주형일 경우(GC rich, AT rich 또는 secondary structure) |
GC rich, 또는 AT rich 주형의 경우 일반적인 반응방법과 시약으로는 분석이 어렵기 때문에 분석 의뢰시 이 부분에 대해 미리 명시해 주시기 바랍니다. |
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Sudden drop in signal |
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- Early sudden drop with sequence termination |
DNA 중합효소가 염기서열 분석이 어려운 부분에서 멈추거나 더 이상 진행하지 못하는 경우 |
• 염기서열의 내용에 따라 별도 시약(dGTP kits, dRhodamine kits, or Bigdye primer kits)을 사용하여 분석해야 합니다. • 만일 염기서열 분석 종결이 헤어핀(hairpins) 구조나 이차 구조에 의한 것이라면 문제 영역 주변을 대상으로 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다. |
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- Sudden drop with continued basecalling |
DNA 중합효소가 특정 서열 부분에 대해서만 반응이 진행되지 못하는 경우 |
• 염기서열의 내용에 따라 별도 시약(dGTP kits, dRhodamine kits, or Bigdye primer kits)을 사용하여 분석해야 하므로 별도 문의바랍니다. |
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2차 증폭 산물이 염기서열 주형으로 함께 사용되는 경우 |
PCR 특이도를 높이도록 프로토콜을 변경하십시오(annealing 온도 증가, 낮은 MgCl2 농도, 또는 프라이머 재디자인 등) |
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Top-heavy data |
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- Gradual loss of signal |
염기서열 분석용 주형이 DNA 중합효소의 활성을 저해하는 오염물질을 포함하는 경우 Sequencing template contains a contaminant that inhibits DNA polymerase activity. |
다른 방법으로 주형을 정제하신 후 재의뢰하시기 바랍니다. |
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- Ski slope profile |
주형이 분해되었을 경우 |
염기서열 분석용 주형이 어떻게 준비되고 보관되었는지 살펴보십시오. 다른 방법으로 주형을 준비하시거나, -20도 이하에 보관하신 후 의뢰하시기 바랍니다. |
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- Preferential amplification of short sequence |
PCR 반응 동안 Primer-dimer가 형성되는 경우 |
• Primer-dimer가 형성되는 서열이 포함되지 않도록 PCR 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다. • “Hot start” PCR 효소를 사용하여 primer-dimer 형성을 억제하십시오. |
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Abnormal Peak Shapes |
Shoulders on all peaks |
염기서열 분석용 프라이머에 n+1 또는 n-1의, 부실한 프라이머가 포함될 경우 |
일단 다른 주형으로 재실험을 진행한 후에도 동일한 문제가 발생한다면, 프라이머를 재합성한 뒤 재반응을 요청하시기 바랍니다. |
Peak compressions |
GC-rich 영역 분석시 주로 관찰되는 현상인데, 합성되는 DNA 가닥의 불완전한 변성으로 인한 현상입니다. |
GC-rich 영역을 분석할 수 있는 별도의 시약과 방법을 사용해야 하므로 재반응 의뢰하시기 바랍니다. |
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Double peaks |
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- Peaks under peaks throughout |
주형에 2차 프라이머 부위가 존재하여 동시에 염기서열 분석이 진행되었을 경우 |
새로운 염기서열분석용 프라이머를 디자인하신 후 재의뢰하시기 바랍니다. |
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PCR 산물에 2차 증폭 산물이 포함되어 염기서열 분석용 주형으로 동시에 사용되었을 경우 |
• 분석하고자 하는 주형만을 gel purification 방법으로 분리하시거나, 단일 산물을 얻을 수 있도록 새로운 PCR 프라이머를 디자인하십시오. |
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PCR 프라이머들이 완벽히 제거되지 않은 채 염기서열분석을 실시할 경우 |
PCR 산물을 염기서열분석용 주형으로 사용하기 위해서는 PCR 프라이머가 완전히 제거되어야 합니다. |
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혼합되거나, 오염된 주형 또는 프라이머를 사용했을 경우 |
DNA 또는 프라이머의 품질을 재확인하십시오. |
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- At the beginning of the sequence |
PCR 산물을 염기서열 분석용 주형으로 사용할 경우 관찰될 수 있는 현상입니다. PCR 반응시 primer-dimers가 강하게 형성되기 때문인데, 이러한 primer-dimers끼리 가열-냉각되는 동안 주형이 아닌, 이들만의 서열로 이루어진 짧은 PCR 산물들이 만들어지고, 이들이 주형으로 사용되어 염기서열 반응이 일어나면서 나타나는 현상입니다. |
Primer-dimer 서열에 의해 영향을 받는 영역의 서열이 중요하다면, • Primer-dimer가 형성되는 서열이 포함되지 않도록 PCR 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다. 또는 • “Hot start” PCR 효소를 사용하여 primer-dimer 형성을 억제하십시오. |
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PCR 반응 결과에 1개 이상의 PCR 산물이 존재할 경우 |
Primer 부위의 유사성에 대해 서열을 재검사해 보십시오. |
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염기서열 분석을 위한 주형의 위쪽이나 아래 부위에 1개 이상의 priming 부위가 존재할 경우 |
필요할 경우 프라이머를 다시 디자인하십시오. |
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- Double sequence (n+1 or n-1) throughout |
PCR 프라이머 (또는/그리고) 염기서열 분석용 프라이머에 n+1 또는 n-1 프라이머가 혼합되어 있을 경우. |
일단 다른 주형으로 재실험을 진행한 후에도 동일한 문제가 발생한다면, 프라이머를 재합성한 뒤 재반응을 요청하시기 바랍니다. |
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염기서열 분석용 프라이머에 동일한 핵산 특히 4개나 그 이상의 G(guanine)가 연속해서 존재할 경우 |
동일한 핵산, 특히 4개나 그 이상의 G(guanine)가 연속해서 존재하지 않도록 다시 디자인하신 후 재분석 요청하시기 바랍니다. |
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- After a homopolymer or repeated sequence |
PCR 증폭 또는 염기서열 분석 반응 중 나타나는 “Stutter” 현상은 2개 염기보다 큰 영역의 homopolymorpic 영역에서 흔히 발생합니다. 또는 반복서열의 결과일 수도 있습니다. |
만일 PCR 증폭시 “Stutter” 현상이 발생한다면, 반복 서열을 포함하는 염기서열분석용 프라이머를 이용하는 것 외에 특별한 해결방법이 없습니다. 만일 “Sturrer” 현상이 염기서열 분석반응시 발생한다면, 별도의 시약과 방법을 이용해야 하므로 별도 문의하시기 바랍니다. |
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- Double sequence after clean sequence |
Heterozygous 삽입 및 결실 돌연변이(indel mutation)일 경우. |
• 삽입 또는 결실이 포함되지 않도록 PCR 타겟을 다시 디자인하거나, • 염기서열 데이타 분석시 별도 프로그램을 사용하여 정방향과 역방향 염기서열을 모아서 하나의 서열로 만든 뒤 해석해야 하므로, 이러한 종류의 데이타 분석이 필요할 경우 별도 문의하시기 바랍니다. |
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