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Sequencing

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Source 문제점 원인 해결 방법
Incorrect
Basecalling

Too many mixed bases called

분석하고자 하는 핵산 주형에 2차 프라이머 부위들이 존재할 경우

염기서열분석용 프라이머를 다시 디자인하십시오.

PCR 산물에 이차 증폭 산물이 포함되어 염기서열 분석용 주형으로 이용되었을 경우

• 분석하고자 하는 주형만을 gel purification 방법으로 분리하십시오.

• 새로운 PCR 프라이머를 디자인하거나, 단일 산물을 얻을 수 있도록 증폭 조건을 최적화하십시오.

PCR 프라이머들이 완벽히 제거되지 않은 채 염기서열분석을 실시할 경우

PCR 산물을 염기서열분석용 주형으로 사용하기 위해서는 PCR 프라이머가 완전히 제거되어야 합니다.

주형이 혼합되었을 경우

DNA 품질을 확인하십시오.

PCR 증폭 또는 염기서열 분석 반응 중 나타나는 “Stutter” 현상은 2개 염기보다 큰 영역의 homopolymorpic 영역에서 흔히 발생합니다.

또는 반복서열의 결과일 수도 있습니다.

만일 PCR 증폭시 “Stutter” 현상이 발생한다면, 반복 서열을 포함하는 염기서열분석용 프라이머를 이용하는 것 외에 특별한 해결방법이 없습니다.

Irregular
Signal

No signal or low signal

- No signal

Phenol이나 Ethanol, Washing 용액 등 염기서열 분석반응을 저해하는 용매가 포함되어 있을 경우

일반적으로 추천하는 방법에 따라 염기서열 분석용 주형을 분리해 주십시오. DNA 품질을 확인하시고, 만일 필요할 경우 주형을 정제하십시오.

부실한 프라이머 디자인으로 인해 프라이밍이 약할 경우

새로운 프라이머를 디자인하신 후 염기서열 분석을 다시 의뢰하십시오.

- Low signal throughout

주형, PCR 산물의 불충분한 정제, 또는 염기서열 분석반응을 위한 ethanol 침전시 염(salts)이 포함되어 있을 경우. 이러한 염(salts)은 적절한 전기적 반응을 방해하여 염기서열 분석 결과를 나쁘게 만듭니다.

DNA 품질과 PCR 정제, 그리고, 염기서열 분석반응을 위한 정제 과정을 다시 한번 잘 확인하시기 바랍니다.

부실한 주형의 품질

일반적으로 추천하는 방법에 따라 염기서열 분석용 주형을 분리해 주십시오. DNA 품질을 확인하시고, 만일 필요할 경우 주형을 정제하십시오.

염기서열 분석반응을 확인하기 위해 컨트롤 DNA 주형과 함께 반응을 의뢰하시기 바랍니다.

분석이 어려운 서열을 가진 주형일 경우(GC rich, AT rich 또는 secondary structure)

GC rich, 또는 AT rich 주형의 경우 일반적인 반응방법과 시약으로는 분석이 어렵기 때문에 분석 의뢰시 이 부분에 대해 미리 명시해 주시기 바랍니다.

Sudden drop in signal

- Early sudden drop with sequence termination

DNA 중합효소가 염기서열 분석이 어려운 부분에서 멈추거나 더 이상 진행하지 못하는 경우

• 염기서열의 내용에 따라 별도 시약(dGTP kits, dRhodamine kits, or Bigdye primer kits)을 사용하여 분석해야 합니다.

• 만일 염기서열 분석 종결이 헤어핀(hairpins) 구조나 이차 구조에 의한 것이라면 문제 영역 주변을 대상으로 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다.

- Sudden drop with continued basecalling

DNA 중합효소가 특정 서열 부분에 대해서만 반응이 진행되지 못하는 경우

• 염기서열의 내용에 따라 별도 시약(dGTP kits, dRhodamine kits, or Bigdye primer kits)을 사용하여 분석해야 하므로 별도 문의바랍니다.

2차 증폭 산물이 염기서열 주형으로 함께 사용되는 경우

PCR 특이도를 높이도록 프로토콜을 변경하십시오(annealing 온도 증가, 낮은 MgCl2 농도, 또는 프라이머 재디자인 등)

Top-heavy data

- Gradual loss of signal

염기서열 분석용 주형이 DNA 중합효소의 활성을 저해하는 오염물질을 포함하는 경우

Sequencing template contains a contaminant that inhibits DNA polymerase activity.

다른 방법으로 주형을 정제하신 후 재의뢰하시기 바랍니다.

- Ski slope profile

주형이 분해되었을 경우

염기서열 분석용 주형이 어떻게 준비되고 보관되었는지 살펴보십시오. 다른 방법으로 주형을 준비하시거나, -20도 이하에 보관하신 후 의뢰하시기 바랍니다.

- Preferential amplification of short sequence

PCR 반응 동안 Primer-dimer가 형성되는 경우

• Primer-dimer가 형성되는 서열이 포함되지 않도록 PCR 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다.

• “Hot start” PCR 효소를 사용하여 primer-dimer 형성을 억제하십시오.

Abnormal Peak Shapes

Shoulders on all peaks

염기서열 분석용 프라이머에 n+1 또는 n-1의, 부실한 프라이머가 포함될 경우

일단 다른 주형으로 재실험을 진행한 후에도 동일한 문제가 발생한다면, 프라이머를 재합성한 뒤 재반응을 요청하시기 바랍니다.

Peak compressions

GC-rich 영역 분석시 주로 관찰되는 현상인데, 합성되는 DNA 가닥의 불완전한 변성으로 인한 현상입니다.

GC-rich 영역을 분석할 수 있는 별도의 시약과 방법을 사용해야 하므로 재반응 의뢰하시기 바랍니다.

Double peaks

- Peaks under peaks throughout

주형에 2차 프라이머 부위가 존재하여 동시에 염기서열 분석이 진행되었을 경우

새로운 염기서열분석용 프라이머를 디자인하신 후 재의뢰하시기 바랍니다.

PCR 산물에 2차 증폭 산물이 포함되어 염기서열 분석용 주형으로 동시에 사용되었을 경우

• 분석하고자 하는 주형만을 gel purification 방법으로 분리하시거나, 단일 산물을 얻을 수 있도록 새로운 PCR 프라이머를 디자인하십시오.

PCR 프라이머들이 완벽히 제거되지 않은 채 염기서열분석을 실시할 경우

PCR 산물을 염기서열분석용 주형으로 사용하기 위해서는 PCR 프라이머가 완전히 제거되어야 합니다.

혼합되거나, 오염된 주형 또는 프라이머를 사용했을 경우

DNA 또는 프라이머의 품질을 재확인하십시오.

- At the beginning of the sequence

PCR 산물을 염기서열 분석용 주형으로 사용할 경우 관찰될 수 있는 현상입니다. PCR 반응시 primer-dimers가 강하게 형성되기 때문인데, 이러한 primer-dimers끼리 가열-냉각되는 동안 주형이 아닌, 이들만의 서열로 이루어진 짧은 PCR 산물들이 만들어지고, 이들이 주형으로 사용되어 염기서열 반응이 일어나면서 나타나는 현상입니다.

Primer-dimer 서열에 의해 영향을 받는 영역의 서열이 중요하다면,

• Primer-dimer가 형성되는 서열이 포함되지 않도록 PCR 프라이머를 다시 디자인하시기 바랍니다.

또는

• “Hot start” PCR 효소를 사용하여 primer-dimer 형성을 억제하십시오.

PCR 반응 결과에 1개 이상의 PCR 산물이 존재할 경우

Primer 부위의 유사성에 대해 서열을 재검사해 보십시오.

염기서열 분석을 위한 주형의 위쪽이나 아래 부위에 1개 이상의 priming 부위가 존재할 경우

필요할 경우 프라이머를 다시 디자인하십시오.

- Double sequence (n+1 or n-1) throughout

PCR 프라이머 (또는/그리고) 염기서열 분석용 프라이머에 n+1 또는 n-1 프라이머가 혼합되어 있을 경우.

일단 다른 주형으로 재실험을 진행한 후에도 동일한 문제가 발생한다면, 프라이머를 재합성한 뒤 재반응을 요청하시기 바랍니다.

염기서열 분석용 프라이머에 동일한 핵산 특히 4개나 그 이상의 G(guanine)가 연속해서 존재할 경우

동일한 핵산, 특히 4개나 그 이상의 G(guanine)가 연속해서 존재하지 않도록 다시 디자인하신 후 재분석 요청하시기 바랍니다.

- After a homopolymer or repeated sequence

PCR 증폭 또는 염기서열 분석 반응 중 나타나는 “Stutter” 현상은 2개 염기보다 큰 영역의 homopolymorpic 영역에서 흔히 발생합니다.

또는 반복서열의 결과일 수도 있습니다.

만일 PCR 증폭시 “Stutter” 현상이 발생한다면, 반복 서열을 포함하는 염기서열분석용 프라이머를 이용하는 것 외에 특별한 해결방법이 없습니다.

만일 “Sturrer” 현상이 염기서열 분석반응시 발생한다면, 별도의 시약과 방법을 이용해야 하므로 별도 문의하시기 바랍니다.

- Double sequence after clean sequence

Heterozygous 삽입 및 결실 돌연변이(indel mutation)일 경우.

• 삽입 또는 결실이 포함되지 않도록 PCR 타겟을 다시 디자인하거나,

• 염기서열 데이타 분석시 별도 프로그램을 사용하여 정방향과 역방향 염기서열을 모아서 하나의 서열로 만든 뒤 해석해야 하므로, 이러한 종류의 데이타 분석이 필요할 경우 별도 문의하시기 바랍니다.





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